相對定量原理

  在某些不需要對基因進行絕付定量，只需要確定基因相對表達差異的情況下，如某基因在經(jīng)過某種處理后表達量是增加了還是減少了，用相對定量的方法就可以得到結(jié)果。相對定量是一種更普遍、更簡單的方法。機體的細胞中，一些基因的表達量是恒定的，這些基因可以被用作內(nèi)部參照（簡稱內(nèi)參）基因。相對定量就是通過檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達變化來實現(xiàn)定量的。正確選擇內(nèi)參可以平均起始樣本質(zhì)和量的誤差，以及反應(yīng)效率的誤差。內(nèi)參需滿足：①在研究中樣本之間的表達是相似的；②處理因素不會影響其表達；③與待測基因同時進行相同的擴增。在開始實驗之前，須對所選擇的內(nèi)參進行上述分析。

  一般推薦使用內(nèi)源性管家基因（housekeeping gene）作為內(nèi)參基因，管家基因的作用主 要有：①用于與目的基因拷貝數(shù)的比較；②作為內(nèi)對照補償待測樣本核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴增的影響因素；③參照物標準化。由 于管家基因在各種組織中是恒定表達的，所以可以用管家基因的量作為某種標準，以比較來源不同的樣本目的基因表達量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH、β2-tublin, β-actin、 efla、Cyclophilin和16SrRNA等。盡管在大多數(shù)情況下這些管家基因的表達非常穩(wěn)定，但是近有報道認為這些管家基因的表達在某些情況下會發(fā)生變化。也就是說，并不是任何管家基因都適合任何試驗。在選擇內(nèi)參基因時，應(yīng)仔細考慮各種因素，選擇合適的管家基因或管家基因組合。使用管家基因進行相對定量不僅比定量更加簡單、經(jīng)濟，而且也更為可靠和準確，但是管家基因畢競與目的基因存在較大的異源性，所以在反應(yīng)過程中會出現(xiàn)擴增效率不一致的問題。下面將具體介紹各種相對定量的方法。

 （一）標準曲線法相對定量

  此方法與定量的標準曲線法基本相似。不同之處是定量中只用構(gòu)建目的基因的標準曲線，而且用于構(gòu)建標準曲線的標準品的量是預(yù)先已知的。而相對定量中需要同時構(gòu)建目的基因和內(nèi)參基因兩條標準曲線，并且相對定量中所用的標準品不用知道其準確的拷貝數(shù)或濃度，只要知道其相對稀釋度即可。

  相對定量法中必須選定一個用于表達差異分析的參照體系，而且終得到的結(jié)果——未知樣品的量是相對于某個參照物的量而言的。該方法的步是制備標準品，包括目的基因的標準品與內(nèi)參基因的標準品。標準品可以不知道準確拷貝數(shù)或濃度，但必須準確地進行倍 比稀釋，一般為10倍的倍比稀釋。第二步就是分別將系列稀釋的目的基因標準品和內(nèi)參基因標準品制成標準曲線。然后根據(jù)標準曲線得出未知樣品和參照樣品中的目的基因和內(nèi)參基 因的表達量，并用內(nèi)參進行均一化，即將目的基因的數(shù)量（微克、納克或拷貝數(shù)）除以與之相應(yīng)的內(nèi)參基因數(shù)量，可以看出，既定目的基因在參照體系中的表達量為1x，那么目的基因在其情況下的表達量以相對于參照體系的n倍表示，當標準品內(nèi)參照因子與目的基因擴增效率不同時，可以用該方法進行相對定量。

 （二）2-△△Ct法相對定量

  1、介紹

  2^-△△Ct法又稱為比較Ct法，其與標準曲線法類似，只不過其是用數(shù)學(xué)公式來取得同樣的相對定量結(jié)果，所不同的是其要求靶基因與參比內(nèi)標具有相同的擴增效率。在基因表達的研究中，一般我們只需要知道某個基因在不同時間或不同組織器官中表達水平的差異即可。所用的內(nèi)標通常是一些隨時間及組織變化不大的管家基因如16srRNA、β-actin、GAPDH等。

  2^-△△Ct表示如果對反應(yīng)條件進行優(yōu)化使擴增效率接近1，那么實驗樣本經(jīng)過均一化處理后相對于參照樣本就是2^-△△Ct

相對倍數(shù)（實驗組/參照組）=2^-△△Ct

   2、2^-△△Ct法計算

 在進行2-△△Ct 相對定量時實驗體系中必須包含實驗組和參照組、目的基因和內(nèi)參基因。

          △Ct目的基因=Ct（目的基因）-Ct（同一樣本內(nèi)參基因）

          △△Ct目的基因=實驗組△Ct目的基因-參照組△Ct目的基因

  參照樣本的選擇根據(jù)不同的實驗類型確定的，其應(yīng)用有以下3中情況：

        （1）某種處理方法對基因表達的影響。

        （2）檢測基因在不同時間的表達差異。

        （3）比較基因在不同組織或樣本中的表達差異。